Cromatografia a colonna convenzionale
2. Colonnacromatografica (tipo di rotazione)
3. Colonnacromatografica (manuale)
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Descrizione
Parametri tecnici
Cromatografia a colonna convenzionaleUtilizza la differenza nei rapporti di distribuzione delle diverse sostanze tra la fase stazionaria e la fase mobile, o le diverse capacità di ritenzione delle fasi fisse rispetto alle diverse sostanze, per raggiungere la separazione delle sostanze. Quando la miscela scorre attraverso la colonna cromatografica con la fase mobile, interagirà con la fase stazionaria nella colonna (come dissoluzione, adsorbimento, ecc.). A causa delle differenze nelle proprietà fisiche e chimiche e nelle strutture di ciascun componente nella miscela, anche la grandezza e la resistenza delle loro interazioni con la fase stazionaria variano. Sotto la stessa forza trainante, il tempo di ritenzione di ciascun componente nella fase stazionaria è diverso, in modo che i componenti nella miscela fuoriescono dalla colonna in un certo ordine, raggiungendo la separazione.
Parametro
Rilevazione dei residui di pesticidi
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Lo diciamo spessoCromatografia a colonna convenzionaleè in realtà la separazione della cromatografia a colonna, nota anche come cromatografia a colonna. Fu inventato e utilizzato per la prima volta dagli scienziati russi nel 1903. Ha schiacciato una soluzione di pigmenti vegetali in polvere di carbonato di calcio e ha trovato fasce di colore diverse sulla polvere di carbonato di calcio dall'alto verso il basso. Separando ed estraendo bande di colore diverse, sono state ottenute clorofilla relativamente pura, luteina, ecc..
Dopo cento anni di sviluppo, questo metodo è diventato relativamente maturo e la fase stazionaria si è anche evoluta da una singola polvere di carbonato di calcio all'allumina (che può essere divisa in acido, neutro, alcalino), gel di silice, carbone attivo, ecc.
La fase stazionaria (gel di silice) deve generalmente essere purificata e attivata e la dimensione delle particelle dovrebbe essere uniforme. In teoria, maggiore è la dimensione delle particelle e maggiore è la superficie per unità di massa, maggiore è la capacità di adsorbimento e migliore è l'effetto di separazione.
Tuttavia, in uso pratico, quando le particelle di fase fissa sono troppo piccole, ci sono spesso due situazioni: una è che sono più leggeri di peso e facilmente galleggiano nell'aria (il gel di silice non può essere degradato dal corpo umano e più fine, più è tossico); In secondo luogo, le piccole particelle possono anche portare a piccoli lacune tra particelle, con conseguente portata del solvente lento e consumo di tempo; Prendendo il silicone come esempio, la più grande dimensione commerciale di silicone è attualmente 200-300 mesh.
In termini di metodi di passaggio della colonna, oltre alle apparecchiature di analisi automatica come la preparazione della circolazione in avanti, la preparazione efficiente della fase liquida e le macchine di passaggio della colonna menzionate in precedenza, il passaggio della colonna manuale è principalmente diviso in tre tipi: passaggio della colonna di pressione atmosferica, passaggio della colonna di depressurizzazione e passaggio della colonna di pressurizzazione.
Tra questi, la depressurizzazione attraverso la colonna si traduce in una scarsa efficienza di adsorbimento dovuta alla rapida portata dell'eluente, che porta alla perdita della maggior parte del numero di vassoi e scarsa efficienza di separazione. È adatto per separare campioni con piastre TLC relativamente aperte, in particolare per campioni con una sola grande impurità polare nel prodotto; La maggior parte del suo tempo viene dedicato al pretrattamento dei composti, rimuovendo alcune impurità prima di un'attenta purificazione. Va notato che l'evaporazione del solvente causato dalla pressione negativa durante l'uso può portare alla condensa di un gran numero di gocce d'acqua sulla superficie esterna della colonna. I composti sensibili all'acqua non devono essere facilmente tentati.
Il passaggio della colonna di pressione atmosferica è il metodo di separazione più efficace tra i tre, ma poiché il solvente spesso si muove troppo lentamente, anche il miglior effetto di separazione può influire sull'efficienza. Pertanto, la pressione viene solitamente applicata in questo momento, che si chiama colonna pressurizzata che passa; Ma la pressione non dovrebbe essere troppo alta. Generalmente, una sfera a doppia catena viene utilizzata per il funzionamento manuale e una pompa di pesce viene utilizzata per il funzionamento automatico. Entrambi possono essere modificati come mostrato nella foto.
Processo di attraversamento della colonna convenzionale:
Il lavoro di preparazione dovrebbe essere fatto bene:
Quando si seleziona una colonna, osservare se esiste una tavola di levigatura. Per colonne senza tavole di levigatura, ricorda di riempire il fondo con un po 'di cotone. Il cotone non dovrebbe essere troppo denso o troppo sottile, purché possa bloccare il silicone di staccarsi. (Il blogger ha smantellato direttamente un gancio di vestiti e lo ha usato per inserire il cotone nella presa sulla spina)
Preparare la polarità minima eluente, lampada UV (consigliata per il personale di laboratorio, portatile, pronto a scattare una foto in qualsiasi momento), attrezzatura a pressione e rack del tubo se necessario!
Seleziona una colonna idonea, aggiungi il gel di silicone, immergi il gel di silicone e appiattilo
La selezione diCromatografia a colonna convenzionaleè molto importante e le loro dimensioni dovrebbero essere calcolate in base alla quantità di prodotto, che può generalmente essere divisa in:
Alcuni milligrammi di colonna (la scelta finale per la sintesi totale);
Una colonna di diverse decine di milligrammi (substrato di espansione metodologica);
500 milligrammi a 1 grammo di colonna (usando la metodologia come materia prima);
Pilastri intorno al 5G e scale più grandi.
Il rapporto più comune tra diametro della colonna e altezza in laboratorio è generalmente compreso tra 1: 2,5 e 1:15. La quantità di gel di silice utilizzato come fase stazionaria durante il caricamento del campione è di circa 20-40 volte quella del campione. Lo standard per la selezione delle colonne dovrebbe essere basato sulla situazione di arrampicata sulla piastra TLC del campione. Se ci sono molte impurità nelle immediate vicinanze, prova a scegliere una colonna più grande il più possibile, in modo che il campione possa essere coperto con un piccolo strato sottile (spessore consigliato al di sotto di 5 mm). Se le impurità sono lontane, questo spessore può essere naturalmente aumentato, ma non si raccomanda che lo spessore del campione superasse 2 cm, a meno che il prodotto non venga semplicemente lavato.
Molte persone commettono un errore nel pensare che l'aggiunta di più silicone, anche se è più spesso sul mio campione, può essere separato bene? Questa risposta è negativa!
Il motivo è che queste persone non hanno mai pensato che i campioni sotto e sopra non fossero in esecuzione sulla stessa linea, quindi potevano ottenere solo alcuni puri, la maggior parte dei quali erano incrociati, per non parlare di quelli impuri, perdendo tempo e solventi!
Questo è anche il motivo per cui il campione richiede diradamento!
Dopo aver selezionato la colonna, è possibile eseguire l'aggiunta di silicone attraverso un imbuto di alimentazione. Allo stesso tempo, assicurati di indossare una maschera e operare in un cofano. La ragione di ciò non sarà elaborata dal blogger (silicosi).
Per quanto riguarda l'infiltrazione di gel di silice, il processo raccomandato è: in primo luogo, posizionare la colonna di gel di silice con il gel di silice installato verticalmente, appiattire la superficie del gel di silice con la mano, collegare il fondo della colonna di gel di silice a una pompa dell'acqua, pompa fuori dal gel di silice e quindi versare nel minimo polare eluente dall'eccezione. Quando l'eluente sta per fuoriuscire, chiudere la valvola di intercettazione per evitare che il solvente venga pompato nella pompa dell'acqua.
Quindi, sotto pressione, il gel di silicone può essere inzuppato uniformemente eliminando i volumi di sette o otto colonne con la più piccola quantità di agente in via di sviluppo.
Campione sopra
Il campionamento è diviso in campionamento bagnato e campionamento secco.
(1) Campionamento bagnato.
Il metodo consigliato consiste nell'utilizzare una pipetta con una punta di gomma per succhiare il campione, vicino alla sezione superiore del gel di silicone, gocciolare lentamente e uniformemente il campione fino a quando non copre uno strato, quindi smettere di aggiungere il campione e applicare una certa pressione per immergere la sostanza grassa nello strato di gel di silicone; Immergi la sostanza oleosa nello strato di silicone e ripeti questo processo più volte fino a quando non vengono caricati tutti i campioni!
Alcuni nuovi studenti possono essere curiosi del perché questa operazione viene eseguita invece di rivestire l'olio di processo bagnato come la sostanza in una volta?
In effetti, questa operazione può ridurre l'altezza effettiva dello strato campione. A questo punto, la cromatografia a colonna è già iniziata e i campioni successivi sono come solventi che spingono i campioni precedenti ad adsorbi e desorbiti nel gel di silice.
(2) Per quanto riguarda il campionamento a secco.
A meno che non sia assolutamente necessario, non è raccomandato. I campioni solidi sono più raccomandati per essere battuti o cristallizzati. "Sono raccomandati metodi senza scrupoli, acetato di etile contro acqua, cristallizzazione ad ultrasuoni di oscillazione assistita di olio ad alto ebollizione" e "condivisione di un metodo di ricristallizzazione di laboratorio".
Il campionamento a secco porta generalmente due problemi; Da un lato, durante il processo di miscelazione del campione, la possibilità di reazione tra il campione e il gel di silice aumenta a causa della necessità di aumentare la temperatura per l'evaporazione rotante; D'altra parte, il caricamento a secco significa che gli adsorbenti verranno introdotti nello strato di campionamento, aumentando l'altezza dello strato di campionamento o la dimensione della colonna, che richiede più tempo e più solvente.
Se non c'è altra scelta, versare semplicemente la polvere adsorbita lentamente nella colonna per il caricamento, con alcuni requisiti simili ai metodi bagnati.
Aggiungi solfato di sodio anidro o sabbia di quarzo
Al fine di evitare di avere un impatto sullo strato del campione durante l'aggiunta di eluenti, causando irregolarità, deformazione e efficienza di separazione, uno strato di solfato di sodio anidro o sabbia di quarzo è generalmente posata in cima allo strato del campione.
I nostri ingegneri preferiscono personalmente gettare solfato di sodio anidro perché ha anche una funzione di essiccazione ed è amichevole per solventi come il diclorometano, che sono soggetti a volatilizzazione, assorbimento del calore e condensazione!
Eluizione gradiente, campionamento e raccolta
Dopo il caricamento, sciacquare prima la colonna con un piccolo solvente polare (un solvente che non consentirà al prodotto di passare attraverso) per i volumi di colonna 2-3 (un volume di colonna è definito come il volume della fase mobile che scorre dentro e fuori) per garantire l'uniformità, quindi selezionare una proporzione per l'eluizione.
Come scegliere l'eluente che passa attraverso la colonna?
Il rapporto tra eluente è il rapporto quando il prodotto raggiunge un valore RF di circa 0. 2 sulla piastra TLC
Questa è l'esperienza del lavaggio delle colonne che ho letto molti libri e condivisi e anche il processo effettivo è molto simile. Personalmente, preferisco ridurre il gradiente di due volte.
Ad esempio, se il solvente per l'arrampicata sulla piastra TLC è pe/ea =2: 1, il blogger ha maggiori probabilità di iniziare l'eluizione del gradiente da pe/ea =4: 1 e finire su PE/EA =2: 1, generalmente risultando in risultati migliori.
Ci sono anche tecniche quando si raccolgono eluenti. È possibile prima scegliere un tubo di prova più grande per riceverlo e quando TLC si avvicina al punto di destinazione, passare a un tubo di prova più piccolo. Ciò può ridurre la possibilità di ricevere di più ed evitare impurità.
Se si incontrano situazioni in cui i punti di impurità e i punti del prodotto sono vicini, in particolare quelli con fluorescenza debole, ricorda di non applicare la pressione. Invece, scegli di passare la colonna sotto la pressione normale e cambiare il tubo ogni volta che sono collegate la metà o meno i tubi, il che può anche aumentare la probabilità di purificazione.
Ricorda di non gestire il pilastro in modo tempestivo!
Molte persone hanno l'abitudine di presumere che la colonna sia stata approvata ed essiccata quando non esiste un prodotto in uno o due tubi dopo TLC nella fase successiva.
Mi sono reso conto solo che la resa era troppo bassa quando l'ho calcolata o quando sono andato a fare uno spettro, ho scoperto che lo spettro non era corretto e mancava il punto sbagliato. Me ne sono pentito profondamente.
Quindi si consiglia di non correre per elaborare la colonna dopo aver completato il punto desiderato. Invece, eseguire una risonanza magnetica nucleare per abbinare la resa prima dell'elaborazione.
Se sei impegnato o hai fretta di purificare altri composti con questoCromatografia a colonna convenzionale, si consiglia di sciacquare con un solvente misto benigno ad alta polarità e lasciare questa parte dell'eluente separatamente per i risultati di identificazione.
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